I群禽腺病毒感染诊断技术_老木一支笔专业编制可行性研究分析报告_资金项目立项申请报告

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I群禽腺病毒感染诊断技术

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1　范围
本标准规定了I群禽腺病毒样品的采集与保存、病毒的分离和鉴定等的技术要求。
本标准中I群禽腺病毒分离与鉴定技术适用于I群禽腺病毒中12种血清型病毒的分离鉴定、间接免疫荧光试验（IFA）适用于上述病毒的检测、限制性片段长度多态性分析（RFLP）适用于对I群禽腺病毒12种血清型病毒的鉴定。
2　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫
3　术语和定义
下列定义和术语适用于本文件。
3.1　
I群禽腺病毒 Fowl adenovirus group I
是引起家禽包涵体肝炎和肝炎-心包积液综合征的病原，基于交叉中和试验结果，该病毒可分为12种血清型。
3.2　
间接免疫荧光试验 Indirect immunofluorescence assay （IFA）
用对应某一种抗原的抗体(这里被称为一抗)与细胞孵育结合，在采用对应一抗(也就是抗一抗)的抗体(这里被称为二抗，二抗上偶联有荧光素分子)与细胞孵育结合后在荧光显微镜下观察，出现绿色荧光信号为阳性反应。
3.3　
限制性片段长度多态性分析 Restriction Fragment Length Polymorphism（RFLP）
利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，用于检测DNA序列多态性。
3.4　
LMH细胞
鸡胚肝癌上皮细胞系，来源于雄性鸡肝脏肿瘤。
4　实验室质量控制
4.1　实验室符合GB19489和GB/T 27401要求，实验室必须为生物安全Ⅱ级（BSL-2级）及以上实验室。
4.1.1　操作中注意事项
4.1.1.1　从事PCR工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电泳检测区，尽可能形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。
4.1.1.2　特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。
4.1.1.3　病毒分离区域的鸡胚接种操作区和细胞培养操作区也应遵循一定的布局原则，避免交叉污染。
4.1.2　注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB可诱发基因突变，试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并通过适当的方式（如焚烧、或送有资质的医用垃圾处理公司）进行无害化处理。
4.1.3　生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医用垃圾处理公司做最终处理。
4.2　人员
操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术。
4.3　仪器设备
a) 生物安全柜；
b) PCR仪；
c) CO2恒温培养箱（37℃恒温）；
d) 台式低温高速离心机（最大转速12000r/min）；
e) 电泳仪；
f) 电泳槽；
g) 紫外凝胶成像仪；
h) 2°C～8°C冰箱；
i) - 20°C冰柜；
j) 微量移液器（最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000 μL），带滤芯的枪头；
k) 孵化器（37℃恒温）；
l) 水平摇床；
m) 电子天平精度为：0.001g；
n) 电磁炉或微波炉；
o) 荧光倒置显微镜（FITC）。
4.4　试剂和材料
除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。
a) 磷酸盐缓冲液（pH=7.0～7.4），见A.1；
b) 细胞培养液（含10%血清的DMEM培养基）；
c) 细胞维持液（含1%血清的DMEM培养基）；
d) 甲醇：丙酮（1:1）固定液；
e) 抗体稀释液PBST，见A.2；
f) 商品化的FITC标记鼠抗兔荧光抗体；
g) 兔抗I群禽腺病毒多克隆抗体（灭活疫苗免疫兔制备）；
h) 50 %甘油；
i) 商品化的DNA提取试剂盒；
j) rTaq DNA聚合酶(5 U/μL)；
k) 10×PCR Buffer；
l) dNTPs（2.5 mmol/L）；
m) 商品化的DNA分子量标准，要求在100 bp～2000 bp之间，有5条以上的指示条带；
n) 1.5 %琼脂糖凝胶，见B.1；
o) 1×TAE缓冲液，见B.2；
p) 溴化乙锭（10μg/μL），见B.3；
q) 核酸电泳加样缓冲液，见B.4；
r) 商品化核酸凝胶纯化试剂盒；
s) DNA限制性内切酶Hae II；
t) 阳性对照标准品，I群禽腺病毒细胞培养物；
u) 阴性对照标准品，高压灭菌的蒸馏水；
v) 本标准中使用的水均按照GB/T6682制备和使用；
w) SPF鸡胚；
x) LMH细胞；
y) Hexon基因扩增引物。
FAV-AF：5’-TGGACATGGGGGCGACCTA-3’；
FAV-AR：5’-AAGGGATTGACGTTGTCCA-3’，扩增片段A长度约为1210 bp；
FAV-BF：5’-AACGTCAATCCCTTCAACCACC-3’ ；
FAV-BR：5’-TTGCCTGTGGCGAAAGGCG-3’，扩增片段B长度约为1350 bp。
上述引物浓度均为50μmol/L。
5　样品采集与处理
5.1　样品采集
采集疑似Ⅰ群禽腺病毒感染死亡家禽肝脏、脾脏和肾脏等组织样品，进行分别处理或同时处理；活禽采集泄殖腔拭子。样品置于密闭容器中冷藏运输，储藏温度不超过4℃，时间不超过24h。
5.2　样品保存
5.2.1　室温条件下样品在1 h～2 h内处理完毕，未能及时处理的样本在4 ℃冰箱中存放，不超过24 h；也可于-20 ℃低温条件下保存，不超过30 d；-70 ℃贮存最佳，不超过1年。
5.2.2　组织研磨液和泄殖腔拭子悬液置于-20 ℃低温条件下保存，不超过2周；-70℃贮存不超过30 d。
5.3　样品处理
5.3.1　在生物安全柜中，取10 g～20 g样品放入灭菌的研钵中，无菌条件下磨碎。
5.3.2　用含有抗生素（青霉素(2000 IU/mL)、链霉素(2 mg/mL)、庆大霉素（50μg/mL）和制霉菌素(1000 IU/mL)等渗磷酸盐缓冲液（PBS，pH值7.0～7.4，附录A.1）配成10 %～20 % (g/mL)的悬液；泄殖腔拭子悬液中抗生素浓度提高5倍。加入抗生素后pH调至7.0～7.4。
5.3.3　5.3.3 样本组织悬液反复冻融3次，经8000 r/min离心10 min，取上清并置4℃过夜，次日接种SPF鸡胚或LMH细胞系。
6　病毒分离
6.1　鸡胚接种
6.1.1　将处理后的样品上清，每份尿囊腔接种（3枚～5枚）9日龄～11日龄SPF鸡胚， 0.2 mL/胚，置于孵化器中，37 ℃孵化120 h。
6.1.2　弃去24 h内死亡胚，24 h～120 h内死亡和存活鸡胚置4 ℃冰箱过夜或-20 ℃冷冻1 h，分别无菌收集尿囊液并进行无菌检查，无菌尿囊液盲传三代。
6.2　细胞接种
6.2.1　将处理后的样品上清接种单层LMH细胞，孵育1 h，吸弃上清，用PBS缓冲液轻轻洗涤2次，吸弃后加入细胞维持液。
6.2.2　70 %以上单层细胞出现细胞病变时，将细胞培养物冻融后，转移至冻存管置于-70 ℃保存，不超过3年。
7　病毒鉴定
7.1　间接免疫荧光法（IFA）
7.1.1　细胞固定
将接种病毒48 h的LMH细胞培养板用PBS缓冲液轻轻洗涤3次～4次，吸弃液体。每孔加入用-20 ℃预冷的甲醇：丙酮（1:1）固定液150μL，置于-20 ℃孵育10 min，吸弃固定液。干燥后用PBS缓冲液洗涤3次。
7.1.2　一抗孵育
用抗体稀释液（PBST，见附录A.2）将兔抗I群禽腺病毒多克隆抗体作1:200倍稀释，每孔加入100μL，置于湿盒中，37 ℃孵育1 h。吸弃后用PBS洗涤3次。
7.1.3　二抗孵育
避光条件下，用PBST将FITC标记鼠抗兔抗体作1:200倍稀释，每孔加入100μL，置于湿盒中，37 ℃孵育1 h。吸弃后用PBS洗涤3 次。
7.1.4　封片观察
加入数滴50 %甘油（附录A.3）封片，置于荧光倒置荧光显微镜（FITC荧光目镜）下，观察是否出现绿色荧光信号。
7.2　限制性片段长度多态性(RFLP)分析
7.2.1　DNA的提取
按照商品化DNA提取试剂盒说明书提取病毒细胞培养物中的总DNA，以此为模板分别扩增Hexon基因的片段A和B。
7.2.2　PCR反应体系
10×PCR Buffer 2.5 μL， dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（50 μmol/L）和下游引物（50 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板3μL，rTaq DNA聚合酶0.25 μL，加ddH2O至25 μL。
7.2.3　PCR反应条件
94 ºC预变性5 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72 ℃ 2 min，进行30个循环；72 ℃延伸10min。
7.2.4　琼脂糖凝胶电泳
分别取18 μL PCR产物（片段A和片段B）与2 μL核酸电泳加样缓冲液混匀后，于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，在位于凝胶中央的孔加入DNA分子量标准。加样后，按照5 V/cm电压，电泳20 min～40 min，每隔10 min观察一次。
7.2.5　琼脂糖凝胶电泳成像
当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下2/5处时，停止电泳。将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪下观察。
7.2.6　PCR产物纯化
按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书对阳性条带回收、纯化，溶解于30μL ddH2O中。测定核酸浓度，确保核酸浓度≥10ng/μL。
7.2.7　分子克隆测序
将纯化的核酸片段进行常规分子克隆、测序，获得的Hexon基因中片段A和片段B的序列。
7.2.8　限制性内切酶酶切
反应体系：PCR产物（片段A或B）17μL、10×缓冲液2μL、HaeⅡ限制性内切酶1μL，总体积为20μL。反应条件：37 ℃孵育1 h，72 ℃作用5 min。
7.2.9　酶切产物电泳
取酶切产物9μL，按照7.2.4的步骤进行琼脂糖凝胶电泳。
7.2.10　序列酶切位点分析
用在线软件NEB cutter2.0分析片段A和片段B中的HaeⅡ限制性酶切位点。
7.2.11　对照设置
每次检测，用相应的阳性对照标准品和阴性对照标准品（LMH细胞），至少设置一个或一个以上的阴性对照和阳性对照。
8　结果判定
8.1　LMH细胞感染I群禽腺病毒，细胞肿胀变圆，呈葡萄串状，细胞间隙增大，IFA检测出现绿色荧光信号。在阳性对照出现绿色荧光信号，阴性对照无条带出现（引物二聚体除外）时，检测样品阳性的表明样品中存在I群禽腺病毒，阴性样品中无I群禽腺病毒。
8.2　阳性对照接种细胞出现细胞病变，IFA检测显示胞浆出现绿色荧光信号（附录C），阴性对照无细胞病变，胞浆未出现绿色荧光信号时，判定检测有效；否则判定检测结果无效，阳性样品用于病毒的血清型鉴定。
8.3　以阳性样品培养物的总DNA为模板，PCR扩增Hexon基因的片段A和B，经限制性酶切多态性分析，与I群禽腺病毒血清分型标准酶切图谱（附录D）比对，确定阳性毒株的血清型。

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